Nederlandse samenvatting
Zuurstofradicalen en antioxidanten in multiple sclerosis
1. Multiple sclerosis
Multiple sclerose (MS) is een chronische ontstekingsziekte van het centraal zenuwstelsel
(CZS, hersenen en ruggenmerg) die vooral veel voorkomt bij jong volwassenen. MS
wordt gekenmerkt door beschadigingen van het myeline, de isolatielaag om de zenuwen.
Door deze beschadigingen wordt de prikkelgeleiding door de zenuwen verminderd,
waardoor verlammings- en uitvalsverschijnselen ontstaan die MS kenmerken. De
beschadigingen aan het myeline worden veroorzaakt door cellen van het
immuunsysteem, voornamelijk witte bloedcellen, die massaal het CZS infiltreren en
ontstekingshaarden (laesies) vormen. Een van de witte bloedcellen die een belangrijke
rol speelt tijdens MS is de monocyt. Eenmaal binnengedrongen in het CZS ontwikkelt de
monocyt zich tot geactiveerde macrofaag, die myeline opneemt (fagocyteren) en
afbreekt.
Voordat monocyten het CZS kunnen binnendringen moeten zij eerst de
bloedvatwand van de hersenen passeren. De bloedvaten van de hersenen zijn anders
georganiseerd dan de bloedvaten in de rest van het lichaam. Ze beschermen de
hersenen doordat ze minder doorlaatbaar zijn voor cellen en grote eiwitten en vormen de
bloed-hersenbarrière (BHB; Figuur 1). De bloedvatwand van de BHB bestaat uit lange
platte cellen, de hersenendotheelcellen, welke verbonden zijn door tight junctions (TJ).
Dit zijn eiwitstructuren die ervoor zorgen dat de hersenendotheelcellen als het ware aan
elkaar geritst zijn en zo een ondoorlaatbaar hekwerk vormen. Astrocyten vormen ook
een belangrijke component van de BHB. Tegen de hersenendotheelcellen bevinden zich
uitlopers van astrocyten, die stoffen uitscheiden, waardoor hersenendotheelcellen TJs
blijven vormen. Tussen de astrocyten en hersenendotheelcellen bevindt zich een
netwerk van eiwitten die uitgescheiden worden door zowel de astrocyten als de
hersenendotheelcellen. Dit netwerk zorgt er samen met de hersenendotheelcellen, TJs
en astrocyten voor dat de BHB ondoorlaatbaar is voor bloedcomponenten en
immuuncellen.

Tijdens MS kunnen monocyten de BHB echter wel passeren. Migratie van monocyten
over de BHB gebeurt in verschillende stappen. Eerst rollen monocyten over het
endotheel, waarna ze zich hechten. Tijdens dit hechten geven monocyten en
hersenendotheelcellen signalen aan elkaar, waardoor ze bijvoorbeeld van vorm kunnen
veranderen en hersenendotheelcellen hun TJs openen. Pas daarna kunnen monocyten
door het hersenendotheel migreren, het CZS in. De signalen kunnen gegeven worden
via kleine eiwitten in de cel, maar ook door zuurstofradicalen.
2. Zuurstofradicalen en antioxidanten
Zuurstofradicalen of vrije radicalen zijn kortlevende, agressieve deeltjes die gevormd
worden tijdens het celmetabolisme. Ook kunnen zuurstofradicalen gevormd en
uitgescheiden worden door witte bloedcellen, zoals macrofagen, om ziekteverwekkers te
doden tijdens ontstekingsreacties. Zuurstofradicalen zijn erg reactief en kunnen reageren
met eiwitten, vetten, en DNA, waardoor ze grote schade toebrengen aan cellen, wat
uiteindelijk kan leiden tot celdood. Cellen kunnen zich beschermen tegen de schadelijke
effecten van zuurstofradicalen met behulp van antioxidanten, die zuurstofradicalen
wegvangen en omzetten tot niet-reactieve stoffen. Naast de antioxidanten die de cel zelf
produceert krijgen we ook antioxidanten binnen via het voedsel. Voorbeelden hiervan
zijn vitamine C en vitamine E. Normaal gesproken beschikken cellen over voldoende
bescherming tegen reactieve zuurstofdeeltjes. Echter, wanneer een onbalans ontstaat
tussen de hoeveelheid zuurstofradicalen die gevormd worden en de hoeveelheid
antioxidanten, bijvoorbeeld doordat de productie van zuurstofradicalen sterk toeneemt of
de antioxidant capaciteit afneemt, ontstaat oxidatieve stress. Onderzoek heeft
aangetoond dat oxidatieve stress een rol speelt bij verscheidene ziektebeelden, zoals
hartziekten, kanker en neurologische aandoeningen, waaronder MS. De studies
beschreven in dit proefschrift richten zich op de rol van zuurstofradicalen tijdens
verschillende fasen van het vormen van ontstekingshaarden in MS en de cellulaire
aanpassingen aan de aanwezigheid van zuurstofradicalen. Een beter begrip van de
processen die plaatsvinden tijdens de vorming van MS laesies zou namelijk kunnen
leiden tot de ontwikkeling van medicijnen die dit proces kunnen stoppen.
3. Promotieonderzoek
3.1 De rol van zuurstofradicalen tijdens monocyt-migratie over de bloed-hersenbarrière
Het doel van het eerste deel van dit proefschrift is uit te zoeken via welke mechanismen
zuurstofradicalen migratie van monocyten over de BHB beïnvloeden. In hoofdstuk 2
laten we zien dat tijdens het hechten van monocyten aan hersenendotheelcellen
zuurstofradicalen gevormd worden, die de doorlaatbaarheid van de BHB vergroten.
Zuurstofradicalen kunnen worden weggevangen door antioxidanten. Een van deze
antioxidanten die we gebruiken in ons onderzoek is lipoinezuur. We laten we zien dat
lipoinezuur in staat is om migratie van monocyten over de BHB te verminderen, zowel in
een celkweek als in het diermodel voor MS, experimentele allergische encephalomyelitis
(EAE). Ratten die behandeld werden met lipoinezuur ontwikkelden niet de
verlammingsverschijnselen die kenmerkend zijn voor EAE, en ook vonden we geen
immuuncellen in het CZS. Lipoinezuur remt migratie van monocyten door de integriteit
van de BHB te beschermen, onder andere door ervoor te zorgen dat zuurstofradicalen
geen veranderingen in de vorm van endotheelcellen kunnen induceren.
Zuurstofradicalen die gevormd worden tijdens de hechting van monocyten aan
hersenendotheelcellen verhogen de doorlaatbaarheid van de BHB door het cytoskelet
(eiwitten die zorgen voor de vorm van een cel) en de TJs van hersenendotheelcellen te
veranderen. Deze veranderingen vinden plaats via kleine eiwitten, die signalen
doorgeven naar andere eiwitten (signaal-transductie). We hebben gevonden dat
superoxide, een van de zuurstofradicalen, signalen doorgeeft in hersenendotheelcellen
via drie van de signaaltransductie-eiwitten (Rho, PI3 kinase en PKB) en dat deze
eiwitten signalen doorgeven aan het cytoskelet en de TJs. Ook hebben we laten zien
dat, wanneer de werking van deze signaal-transductie eiwitten geblokkeerd wordt,
zuurstofradicalen geen veranderingen meer teweeg brengen in het cytoskelet en de TJs
van hersenendotheelcellen en de migratie van monocyten over de BHB vermindert. Dit
wordt beschreven in hoofdstuk 3.
Behalve signaaltransductie-eiwitten kunnen er ook andere eiwitten betrokken zijn bij
superoxide-geïnduceerde BHB-permeabiliteit en monocyt-migratie. Om deze te vinden
hebben we gekeken naar de eiwitexpressie van hersenendotheelcellen voor en na
blootstelling aan superoxide. In hoofdstuk 4 laten we zien dat een aantal eiwitten
veranderd tot expressie komt in superoxide-behandelde hersenendotheelcellen. Een
aantal van deze eiwitten zijn betrokken bij de stofwisseling van cellen, andere eiwitten
zijn betrokken bij de regulatie van het cytoskelet. Een van de eiwitten die verhoogd tot
expressie kwam was peroxiredoxin-1. Dit is een antioxidant, die betrokken is bij
bescherming tegen zuurstofradicalen, maar ook een rol speelt in signaaltransductie. Om
verder te onderzoeken welke rol peroxiredoxin speelt in BHB-permeabiliteit en monocytmigratie
hebben wij een cellijn gemaakt die meer peroxiredoxin tot expressie brengt dan
de normale hersenendotheelcellijn. Verhoogde expressie van peroxiredoxin-1 zorgde
ervoor dat hersenendotheelcellen beter beschermd waren tegen de schadelijke effecten
van zuurstofradicalen. Bovendien zorgde peroxiredoxin-1 ervoor dat monocyten minder
goed in staat waren om over de BHB te migreren. Als we weten welke eiwitten en
signaaltransductieroutes een rol spelen tijdens de migratie van monocyten over de BHB,
kunnen we in de toekomst, door deze eiwitten uit te schakelen, voorkomen dat
monocyten naar het CZS migreren en nieuwe ontstekingshaarden veroorzaken bij MS
patiënten.
3.2 Cellulaire aanpassingen aan oxidatieve stress in het centraal zenuwstelsel
Monocyten produceren niet alleen zuurstofradicalen tijdens migratie over de BHB, maar
ook tijdens het fagocyteren van myeline in het CZS. Alle lichaamscellen kunnen zichzelf
beschermen tegen zuurstofradicalen met antioxidanten (kleine eiwitten en antioxidantenzymen)
die aanwezig zijn in de cel. Echter, wanneer de concentratie van
zuurstofradicalen zo hoog wordt dat de antioxidanten deze niet meer kunnen wegvangen
ontstaat oxidatieve stress. Cellen hebben een mechanisme om zich te beschermen
tegen oxidatieve stress, de zogenaamde oxidatieve stress response. Deze response
zorgt ervoor dat antioxidant-enzymen worden gemaakt, die de cel moeten beschermen
tegen de schadelijke effecten van zuurstofradicalen. In het tweede deel van dit
proefschrift hebben we gekeken naar de expressie en regulatie van deze antioxidantenzymen
in de hersenen van MS patiënten en EAE dieren.
In hoofdstuk 6 hebben we gekeken naar genexpressie van antioxidantenzymen in
hersenen van ratten met EAE. Hieruit bleek dat verschillende antioxidantenzymen
verhoogd tot expressie komen op de piek van de ziekte, wanneer de dieren de ergste
verlammingsverschijnselen hebben. Dit is ook de fase van de ziekte waarin de meeste
monocyten in het CZS te vinden zijn. In de hersenen van ratten die behandeld waren
met de antioxidant lipoinezuur was de expressie van antioxidantenzymen gelijk aan die
van gezonde controle dieren. De verhoogde expressie van antioxidant enzymen
impliceert dat er inderdaad oxidatieve stress optreedt tijdens de piek van EAE. Dat deze
dieren (en ook MS patiënten) toch ziek worden duidt erop dat de expressie van
antioxidant-enzymen niet genoeg is om schade te voorkomen.
Een van de antioxidantenzymen die worden aangemaakt als gevolg van de
oxidatieve stress response is het eiwit NAD(P)H:quinone oxidoreductase, kortweg
NQO1. Dit enzym wordt verhoogd tot expressie gebracht in neurodegeneratieve ziektes
zoals de ziekte van Parkinson en de ziekte van Alzheimer, waarbij zuurstofradicalen ook
een belangrijke rol spelen. In hoofdstuk 7 hebben wij gekeken naar de expressie van
NQO1 in breinen van MS patiënten. Wij zagen dat NQO1 voornamelijk verhoogd tot
expressie wordt gebracht in actieve MS laesies. Behalve naar NQO1 hebben ook
gekeken naar de expressie van andere antioxidant enzymen in MS laesies, zoals
superoxide dismutase (SOD), peroxiredoxin-1 (Prx-1), catalase en heme-oxygenase
(HO-1). Dit staat beschreven in hoofdstuk 8. Deze eiwitten kwamen ook verhoogd tot
expressie in actieve MS laesies. Dit zijn laesies met veel geïnfiltreerde macrofagen die
myeline hebben gegeten, zogenaamde schuimcellen. NQO1 en andere antioxidant
enzymen kwamen met name verhoogd tot expressie in deze schuimcellen en in
astrocyten, maar niet in neuronen (zorgen voor de prikkelgeleiding) en oligodendrocyten
(vormen de myelinelaag om de zenuwen), cellen die juist beschadigd zijn in MS. Wij
denken dat neuronen en oligodendrocyten de capaciteit missen om als reactie op
oxidatieve stress antioxidantenzymen aan te maken, waardoor deze celtypes extra
gevoelig zijn voor oxidatieve stress, zoals optreedt tijdens MS. Als wij bij MS patiënten
deze cellen kunnen prikkelen meer antioxidantenzymen te maken, kunnen wij ze
misschien beschermen tegen de schade die optreedt tijdens MS.

4. Conclusie
Samenvattend hebben we laten zien dat zuurstofradicalen betrokken zijn bij de migratie
van monocyten over de BHB, maar ook bij latere pathologische processen die een rol
spelen tijdens de vorming van ontstekingshaarden in MS. We hebben laten zien welke
signaaltransductieroutes aangezet worden door zuurstofradicalen, waardoor de BHB
open gaat. Met antioxidanten kunnen we deze processen stoppen en daardoor de
migratie van monocyten over de BHB voorkomen. In hersenweefsel van EAE dieren en
MS patiënten zien we dat cellen in het CZS zelf wel meer antioxidantenzymen maken
dan cellen van gezonde mensen, maar blijkbaar is dit niet voldoende om te beschermen
tegen infiltratie van monocyten en tegen de schade die ontstaat door oxidatieve stress.
Het toedienen van antioxidanten of stoffen die de aanmaak van eigen
antioxidantenzymen stimuleren via voedsel of een injectie zou in de toekomst kunnen
helpen om de migratie van monocyten naar het CZS en daarmee het ontstaan van
nieuwe ontstekingshaarden in MS te voorkomen.